李晓东 2022-09-06 394次浏览

《醛固酮对肾小球系膜细胞增殖和合成分泌细胞外基质的影响》

关键词:醛固酮 肾小球系膜细胞

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文件编号: KEYAN666186635666
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中图分类: R965.1
完成/联系人 李晓东
完成单位: 河北医科大学附属唐山工人医院
科研日期:2009
研究行业:
研究主题: 醛固酮,肾小球系膜细胞,受体拮抗剂,细胞外基质,慢性肾脏病,
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联系地址:河北省唐山市路北区文化路27号

任务来源:

“醛固酮对肾小球系膜细胞增殖和合成分泌细胞外基质的影响”项目,是2005年度唐山市科技攻关指令计划项目,编号:05134601A-1,获资助2万元。由唐山市工人医院承担。研究的主要内容:利用体外培养的大鼠肾小球系膜细胞,研究其是否合成分泌醛固酮,表达醛固酮受体;醛固酮及其受体拮抗剂对肾小球系膜细胞增殖、合成分泌细胞外基质、以及细胞因子表达的影响。从而探讨醛固酮在肾小球疾病发病机制中的作用,为临床应用醛固酮受体拮抗剂治疗慢性肾小球疾病提供实验依据。1.大鼠肾小球系膜细胞的培养及鉴定

参照文献王迎伟、Lovett的方法对SD大鼠的肾小球系膜细胞进行原代培养和传代。细胞鉴定:倒置显微镜观察细胞形态、免疫细胞化学染色(SABC法)检测抗结蛋白、抗细胞角蛋白及抗八因子相关抗原的表达。2.大鼠肾小球系膜细胞合成分泌醛固酮并表达醛固酮受体研究

应用放射免疫分析法测定肾小球系膜细胞培养上清中醛固酮的含量;逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR法)检测大鼠肾小球系膜细胞中醛固酮合成酶基因CYP11B2和醛固酮受体mRNA的表达。3.醛固酮及其受体拮抗剂对肾小球系膜细胞增殖的影响 第4~6代肾小球系膜细胞用于实验,将细胞接种于96孔培养板,加入含有不同浓度(10~11、10~10、10~9、10~8、10~7mol/L)醛固酮和/或10~7mol/L螺内酯(醛固酮受体拮抗剂)的培养液,培养24、48和72 h,应用MTT法检测系膜细胞增殖。细胞培养于100mL培养瓶,加入含不同浓度(10~11、10~9、10~7mol/L)醛固酮的培养液培养24 h,用流式细胞术检测细胞周期各时相的百分比。4.醛固酮及其受体拮抗剂对肾小球系膜细胞合成分泌细胞外基质的影响

取第6~8代肾小球系膜细胞,接种于24孔板中。加入含有不同浓度(10~11、10~9、10~7mol/L)醛固酮和/或10~7mol/L 螺内酯的培养液,酶联免疫吸附实验(ELISA法)测定细胞培养上清中纤维连接蛋白和I型胶原的含量。应用RT-PCR法检测细胞中纤维连接蛋白和I型胶原mRNA的表达。5.醛固酮对肾小球系膜细胞转化生长因子β1、结缔组织生长因子、纤溶酶原激活物抑制物1基因表达的影响

取第6~8代肾小球系膜细胞,接种于100mL培养瓶中,加入含有不同浓度(10~11、10~10、10~9、10~8、10~7mol/L)醛固酮的培养液,培养12、24、48、72 h,应用RT-PCR法检测细胞中转化生长因子β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)、纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)的基因表达。研究结论:1.成功培养了大鼠肾小球系膜细胞,倒置显微镜下观察细胞呈梭形,细胞核呈圆形或卵圆形,胞质向外伸出较多长短不一的突起。免疫细胞化学法结果表明,培养的细胞抗结蛋白染色阳性、抗细胞角蛋白、抗八因子相关抗原染色阴性。证实所培养的细胞为大鼠肾小球系膜细胞。2.通过放射免疫分析法研究发现,正常体外培养状态下的大鼠肾小球系膜细胞能够合成分泌醛固酮,通过RT-PCR法证实大鼠肾小球系膜细胞表达醛固酮合成酶基因—CYP11B2。肾小球系膜细胞合成分泌的醛固酮可能在肾脏局部通过自分泌或旁分泌的方式发挥重要作用。通过RT-PCR法研究发现,大鼠肾小球系膜细胞表达醛固酮受体,因此推测,醛固酮可能通过与受体结合对肾小球系膜细胞发挥一定效应。3.应用MTT和流式细胞术研究发现,醛固酮抑制体外培养的肾小球系膜细胞增殖,应用醛固酮受体拮抗剂螺内酯能够拮抗醛固酮的作用,说明这一作用是通过其受体介导的。4.通过ELISA和RT-PCR法研究发现,醛固酮促进体外培养的肾小球系膜细胞合成分泌细胞外基质(纤维连接蛋白和I型胶原),从而促进肾小球疾病进展,导致肾小球硬化。应用醛固酮受体拮抗剂螺内酯能够拮抗醛固酮的上述作用。5.醛固酮促进肾小球系膜细胞TGF-β1、CTGF的基因表达,说明醛固酮可能通过促进致纤维化的细胞因子的表达,进而促进肾小球系膜细胞合成分泌细胞外基质,导致肾小球硬化。同时,醛固酮促进肾小球系膜细胞PAI-1的表达,从而导致细胞外基质降解减少,最终导致肾小球硬化。与国内外研究比较:近年来研究表明,肾素—血管紧张素—醛固酮系统是造成肾脏疾病进展的主要因素之一,临床基础研究表明,阻滞这一系统能有效延缓肾脏疾病进展。过去一直强调血管紧张素Ⅱ是这一系统中造成肾脏损害的主要物质,应用血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素受体拮抗剂能有效降低慢性肾脏病患者的蛋白尿,延缓肾脏病进展。最近动物实验研究表明,醛固酮也是这一系统中造成肾脏损害的重要物质,其作用机制尚不明了。该课题首次全面、系统地研究了体外培养的大鼠肾小球系膜细胞合成分泌醛固酮及醛固酮受体的表达、醛固酮对肾小球系膜细胞增殖、细胞外基质生成的影响及螺内酯的拮抗作用。国内外未见醛固酮对体外培养的肾小球系膜细胞增殖抑制作用的文献报道。赖凌云等报道,醛固酮促进肾小球系膜细胞纤维连接蛋白和IV型胶原的分泌,但国内外未见其对I型胶原的分泌的报道。袁军等报道,醛固酮促进系膜细胞合成PAI-1,其作用可能部分通过活性氧和TGF-β1的表达。CTGF是TGF-β1的下游效应因子,对肾脏细胞的增殖、分化、及细胞外基质的合成和降解具有很强的调控作用,醛固酮对肾小球系膜细胞CTGF表达的影响国内外均未见报道。成果的先进性创新性:1.该课题首次全面、系统地研究了体外培养的大鼠肾小球系膜细胞醛固酮及其受体的表达、醛固酮对肾小球系膜细胞增殖、细胞外基质生成的影响及螺内酯的拮抗作用。2.该课题首次研究了醛固酮对体外培养的肾小球系膜细胞增殖的影响。3.该课题首次研究了醛固酮对体外培养的肾小球系膜细胞合成分泌Ⅰ型胶原的影响。4.该课题首次研究了醛固酮对体外培养的肾小球系膜细胞结缔组织生长因子(CTGF)表达影响。作用意义:慢性肾脏病是一个世界范围内的公共健康问题。国际肾脏学会预测,全球每10人中就有一人患有慢性肾脏病。在发达国家,普通人群的患病率为6.5%~16%,美国慢性肾脏病人数已经超过2000万。在中国,普通人群中慢性肾脏病的患病率也接近10%,40岁以上人数高达18.7%。而肾功能衰竭进行肾脏替换治疗的花费非常巨大,在美国接受透析或肾脏移植治疗的病人约每人每年150万美元。肾脏疾病已经成为全球关注的问题。如何采取有效措施,延缓慢性肾脏病进展是目前肾脏病领域的研究难题。近年来研究表明,肾素—血管紧张素—醛固酮系统是造成肾脏疾病进展的主要因素之一,阻滞这一系统能有效延缓肾脏疾病进展。过去一直强调血管紧张素Ⅱ是这一系统中造成肾脏损害的主要物质,应用血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素受体拮抗剂能有效降低慢性肾脏病患者的蛋白尿,延缓肾脏病进展。但其减少蛋白尿的作用最多达到30%,无法使慢性肾脏病,尤其是糖尿病肾病患者的尿蛋白减少到正常,需要寻找其他的治疗措施。最近动物实验研究表明,醛固酮也是这一系统中造成肾脏损害的重要物质,其作用机制尚不明了。本研究结果表明,正常体外培养状态下的大鼠肾小球系膜细胞能够合成分泌醛固酮,醛固酮促进体外培养的肾小球系膜细胞合成分泌细胞外基质(纤维连接蛋白和I型胶原),应用醛固酮受体拮抗剂螺内酯能够拮抗醛固酮的上述作用。醛固酮促进肾小球系膜细胞TGF-β1、CTGF、PAI-1的基因表达,导致细胞外基质合成增多,而降解减少,最终导致肾小球硬化。本研究阐明了醛固酮在慢性肾小球疾病发病机制中的作用,为临床应用醛固酮受体拮抗剂治疗慢性肾脏病提供理论依据。该科研成果将对慢性肾脏病的治疗提供新的策略,必将带来良好的经济效益和社会效益。推广应用前景与措施慢性肾脏病是一个世界范围内的公共健康问题。如何采取有效措施,延缓慢性肾脏病进展是目前肾脏病领域的研究难题。近年来研究表明,应用血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素受体拮抗剂能有效降低慢性肾脏病患者的蛋白尿,延缓肾脏病进展。但其减少蛋白尿的作用最多达到30%,无法使慢性肾脏病,尤其是糖尿病肾病患者的尿蛋白减少到正常范围,需要寻找其他的治疗措施。动物实验表明,醛固酮也是造成肾脏疾病进展的重要物质,但其确切机制尚不明确。本研究阐明了醛固酮在肾小球疾病发病机制中的作用,醛固酮通过促进肾小球系膜细胞合成分泌细胞外基质以及致纤维化细胞因子的表达,促进肾小球硬化,应用醛固酮受体拮抗剂螺内酯能够拮抗醛固酮的作用。该结论为临床应用醛固酮受体拮抗剂治疗慢性肾脏病提供了理论依据。最近,我们应用小剂量螺内酯联合血管紧张素转化酶抑制剂洛丁新(贝那普利),显著减少慢性肾小球肾炎和糖尿病肾病患者蛋白尿,取得了显著疗效。推广应用醛固酮受体拮抗剂应用于慢性肾脏病以及糖尿病肾病的治疗,延缓肾脏疾病进展,必将产生巨大的经济效益和社会效益。但是,我们应该注意,其疗效仍需要临床多中心、大样本资料的验证,其安全性仍需进一步观察。

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